SPOS技術：血細胞應用

簡介：Accusizer780測試紅細胞和白細胞的粒徑分布和顆粒計數

傳統上，紅細胞和白細胞的計數分布都是通過電阻法測試的。粒子分散在導電介質中，當粒子通過一個小孔時會導致電阻的增加、電導率的下降，電阻的響應值與粒子大小和體積有關。雖然這項技術多年來應用良好，但本文可證明，使用SPOS（單粒子光學傳感技術）結合自動稀釋的顆粒計數器可更容易地確定紅細胞和白細胞的粒徑大小，與電阻法相比，可用的稀釋劑種類更多，限制更小。

Accusizer780采用光阻法，單粒子光學傳感技術(SPOS)的原理，可同時測試粒徑分布和顆粒計數。傳感器內部有一個激光，單個粒子在經過光感區域時，對激光造成遮擋，從而導致光強度下降，光強的減弱與粒子的橫截面積成比例。Accusizer780配置有自動稀釋模塊，當樣品濃度過高，導致多個粒子可能同時通過傳感器感應區域(這個概率與顆粒濃度有關)，此時樣品會被自動稀釋。儀器可允許稀釋后的樣品在短時間間隔內同時計數粒子（500,000#/min），而避免粒子間的重合效應，這意味著粒子間不會相互遮擋，一次計數一個粒子，得到真實的粒度分布和統計精度。這其中僅需一條校準曲線即可將脈沖電壓轉換成相應的粒徑，不需要復雜的數學算法。由于儀器具有自動稀釋的能力，且一次計數一個粒子，因此可確定所有經過傳感器的粒子都會被統計在內，且不會造成重復計數。這種測試方式決定了儀器在粒徑分布上的高分辨率，尤其對于粒徑主體分布小于1um的樣品，可觀測到尾端粒子的復雜分布情況。如前所述，Accusizer780顆粒計數器不僅能得到樣品的粒徑分布，還能做到顆粒計數。

本文采用配有自動稀釋功能的Accusizer780進行實驗，用來測試一種新儀器的效率，該儀器可將血細胞的主要成分進行分離。在大多數醫院，血細胞都是用電阻法進行顆粒計數分析。電阻顆粒計數器由兩個電極，電解質鹽溶液，一個帶有小孔的非導電玻璃罩組成，電荷可從一個電極流向另一個電極。血液樣品注入樣品池的一端后，由于玻璃小孔一端的壓力差不同，液體會流經小孔，從而導致電極間的電荷流動，相應的電流會發生變化，或維持電流不變，電壓增加，電壓或電流的響應值與樣品池的排除體積成比例。通過這種方法，可確定血細胞的粒徑分布和顆粒濃度。

電阻法有以下缺陷：① 電阻法要求樣品懸浮在高導電率的分散劑中，這大大增加了操作成本；② 玻璃小孔很容易堵塞；③ 小孔的規格很小，會限制樣品的流經速度，從而限制粒子的計數速率，以上這些因素都限制了電阻法測試血細胞的粒度分布和計數的使用。Accusizer780則沒有以上問題存在，該技術基于光阻法的原理，任何合適的稀釋劑都可使用。這一點對于血細胞分離裝置很重要，因為它需要多種不同的緩沖液來實現不同程度的分離，而其他離子的存在會對分離產生不利影響。Accusizer780的樣品流動池與紅細胞和白細胞(凝塊及其他大的凝聚物)的大小相比，流動池的尺寸很大，因此很少發生堵塞。重要的是，儀器的稀釋速度可高達120ml/min，對于來自分離器的高濃度血液成分，可做到快速的自動稀釋以及顆粒計數。

該實驗測試的樣品為血細胞，范圍從紅細胞居多的成分到白細胞居多的成分，總共分析了六個組分，命名從4到9。在“AN160”文獻中，通過對樣品4的zeta電位的檢測可確定，樣品4中幾乎是紅細胞，而5~9號樣品則分別含有越來越多的白細胞。

圖1顯示了Accusizer780測試不同樣品的粒徑分布圖：

 圖1：不同組分的血液樣品疊加圖

除4號樣品外，其他樣品的粒徑分布均由兩個窄峰組成。首峰的粒徑在8.5um左右，是紅細胞的粒徑大小，第二個峰粒徑分布在11-12um左右，與白細胞的粒徑大小匹配，所以可識別紅細胞（首峰）和白細胞（第二個峰）的粒度分布及濃度占比。需注意的是，在圖1中，第二個峰的濃度分布在樣品4中幾乎為0，但后續幾個樣品中數目越來越大。首先，這說明樣品4實際上是紅細胞，其次這一數據還表明，其他樣品中的白細胞組分變得更加豐富。圖2繪制了白細胞與紅細胞的體積和計數的比率圖。

圖2：a. 紅細胞與白細胞的體積占比圖  b. 紅細胞與白細胞的數目占比圖

圖2a為峰2與峰1的體積占比，圖2b為峰2與峰1的數目占比，這些數據可表明血液分離裝置將紅細胞和白細胞分離的程度大小。值得一提的是，樣品4中的紅細胞與白細胞的數目占比約為500:1（圖中顯示為0.002），但樣品5-9中，占比在逐漸增加（樣品9的比率接近0.3，約是正常值的100倍），這進一步說明了分離裝置的效率。這一數據還表明，Accusizer780可以用于定量測量樣品中紅血球和白細胞的相對數量。

若使用電阻法測試白細胞數量，則在測試前須先溶解（破壞）紅細胞，因為紅細胞的數量往往會使白細胞的計數變得更困難及不。*，溶解會對紅細胞和白細胞造成影響，使得紅細胞幾乎被破壞，而白細胞的細胞膜則被剝去并團聚在一起，形成不同的顆粒。圖3測試了樣品6在溶解后的粒度分布，在6-7um處出現一個單峰，且顆粒數目大大減少。根據我們已知的化學溶解效應，圖3中的分布粒徑是白細胞溶解后的殘留，而實際存在的第二個窄峰在溶解后就消失了。

綜上所述，本文提供的數據表明，SPOS可以同時測試紅血球和白細胞的粒徑分布和顆粒濃度。此外，還可配置自動稀釋模塊對樣品進行自動稀釋，用這種方法可在不溶解紅細胞的前提下，對紅細胞和白細胞進行定量分析。研究表明，溶解會破壞紅細胞，但只會將白細胞的粒徑大小從12um降低到6.5um左右。